カンピロバクター ジェジュニ株の紫外線に対する感受性の違いの調査

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9459 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

カンピロバクター ジェジュニは、依然として世界中の公衆衛生において最優先事項となっています。 紫外線発光ダイオード技術 (UV-LED) は現在、食品中のカンピロバクターのレベルを減らすために研究されています。 しかし、種や菌株の感受性の違い、細菌ゲノムに対する繰り返しのUV処理の影響、抗菌交差防御の促進やバイオフィルム形成の誘導の可能性などの課題が生じています。 我々は、8 つの C. jejuni 臨床分離株および農場分離株の UV-LED 曝露に対する感受性を調査しました。 280 nmのUV光は株間で異なる不活化反応速度を誘導し、そのうち3株は1.62 log CFU/mLを超える減少を示しましたが、1株は特にUV光に耐性があり、最大減少量は0.39 log CFU/mLでした。 ただし、不活化はこれら 3 株では 0.46 ～ 1.03 log CFU/mL 減少し、2 回の UV サイクルの繰り返し後の耐性分離株では 1.20 log CFU/mL に増加しました。 紫外線曝露に関連するゲノム変化は、WGS を使用して分析されました。 UV 曝露後に表現型反応が変化した C. jejuni 株では、バイオフィルム形成とエタノールおよび表面洗浄剤に対する感受性が変化することも判明しました。

カンピロバクター属現在、最も一般的な食中毒病原体の一部であり、世界中で毎年約 5 億件のカンピロバクター症の症例に関連していると推定されています。 ほとんどの場合、カンピロバクター ジェジュニが原因物質として報告されています1。 家禽肉はカンピロバクター属菌に汚染されていることがよくあります (60 ～ 80%)。 ヒトへの主な感染源と考えられています。 家禽の大規模生産により、群れ間で C. jejuni が蔓延し、その結果、小売家禽肉中にこの細菌が高レベルで含まれるようになりました。 その結果、家禽肉中の C. jejuni の数を減らすために、農場および加工レベルで努力が払われてきました。 家禽生産チェーンにおける潜在的な介入として、抗菌剤、ワクチン、熱水、死骸の蒸気処理などのいくつかの介入が研究されています2。

紫外線 (UV) 光は、表面、水、空気の微生物の除染に有効であるため、潜在的な消毒技術として浮上しています。 この非熱技術の液体食品および食品表面への応用は、将来の食物連鎖への導入を目的として、農産物分野でも評価されています3。 UV 光は電磁スペクトルの 100 ～ 400 nm の特定の波長範囲にありますが、UV-C としても知られる 200 ～ 280 nm の領域は、広範囲の微生物に対して最大の不活化効果があることが示されています。 。 UV-C の作用機序は文献 4,5 に詳しく記載されており、シクロブタン ピリミジン二量体 (CPD) やピリミジン 6-4 ピリミドン光化学反応生成物 (6-4PP) などの DNA 内での二量体の形成が関与しており、これにより病変が生じます。 これらの損傷は RNA 転写と DNA 複製を妨害し、細胞の正常な機能を破壊し、細胞死を引き起こします 3,4。

UV 光の生成には、水銀ランプ装置が産業界で広く使用されています。 しかし、水銀は有毒な脅威をもたらし、人間や環境に影響を与える可能性があります。 したがって、この問題を克服するために、UV 発光ダイオード (UV-LED) 技術などの他の代替手段が近年登場しました。 UV-LED デバイスは、特に低コスト、高耐久性、低熱とエネルギー放出、柔軟性などの水銀ランプに他の利点をもたらします。 それにもかかわらず、これらの新しい装置は、農産食品分野における消毒戦略としての潜在的な実装についてはさらなる研究が必要です5、6。

Alvarez-Ordonez et al.7 によると、食品の汚染除去に使用される紫外線などの新しい処理技術は、一部の細菌の適応反応を引き起こし、ストレスの特徴的な亜致死性により細胞の持続性を高める可能性があります。 したがって、同じ技術で数回の処理を行うと、消毒の効果が低下する可能性があります7。 特に、紫外線処理は、微生物の増殖速度、マトリックスの光学特性、微生物の株と種の違いによって影響を受けることが証明されています。 後者は、同じ種の菌株でも UV 耐性の大きなばらつきが示されている場合に、UV 光の有効性を評価する場合に関連する可能性があります8。 例えば、Haughton et al.9 は、UV ランプと UV-LED デバイスを適用した場合、10 種類のカンピロバクター株の不活化反応速度にかなりのばらつきがあることを観察しました。 別の研究では、紫外線に曝露されたリステリア モノサイトゲネス株間で異なる感受性が確認されましたが、増殖期は感受性に影響しませんでした10。 UV 光に耐える株固有の変動の証拠は、UV-LED 実装の将来の見通しを裏付けるために、この現象を理解するにはさらに多くの情報が必要であることを示唆しています 11。 この技術の使用に関しては、細菌細胞の感受性、バイオフィルム形成、および/または消毒剤に対する感受性の低下に対する共選択に対する繰り返しの UV 処理の影響など、他の課題も存在します。 UV 曝露後の細菌細胞におけるバイオフィルム形成と UV 耐性との関連性は十分に解明されていませんが、UV 光に対する耐性は、エタノール、酸、熱、過酸化水素などのストレッサーに対して交差保護効果があることが示されています。 しかし、この交差保護現象を評価した研究は、確固たる結論を引き出すには十分ではありません7、10、11、12。

この研究の目的は次のとおりでした: (i) UV-LED 光 (UV280) への 1 回曝露に対する C. ジェジュニ フィールド分離株 8 株と参照株 1 株の感受性、および UV280 ベースの繰り返し曝露に対する前者の 4 株の感受性を調査すること。 (ii) 全ゲノムシークエンシング (WGS) を使用して治療後に観察されたゲノム変化を調べるため、(iii) UV280 による治療により消毒用化学薬品に対する耐性が増加するか、またはバイオフィルム形成を誘導するかどうかを評価する。

9 つの C. ジェジュニ株に対する 1、3、5、7、および 11 分間の UV280 への曝露の影響を図 1 に示します。一般に、研究したすべての C. ジェジュニ株は、試験後 0.8 Log CFU/mL を超える減少を示しました。 11 分間の UV 光曝露。NCTC 11168 は例外で、特に UV 不活化効果に強く、最大減少量は 0.39 ± 0.23 Log CFU/mL でした。 MF6671 は UV 光曝露に対して最も感受性が高く、細菌減少率が最も高かった (1.62 ± 0.33 Log CFU/mL)、次いで MF716 (1.59 ± 0.37 Log CFU/mL)、MF13415 (1.51 ± 0.19 Log CFU/mL) でした。 280 nmのUVを照射した場合、これらの菌株間で不活化反応速度の違いが観察されました。 9 株のうち 7 株は、より長い UV 光処理に対して耐性があり、11 分の処理時間では、より短い処理時間よりも有意に高い細菌減少は生じませんでした (p ≥ 0.05)。

280 nmで0、1、3、7、9および11分間のUV曝露の前後で9つのC.ジェジュニ株で観察された細菌の減少(Log CFU/mL)。 治療間の統計的差異は * で示されています (p < 0.05)。

図 1 に示すように、280 nm の UV 光下で不活化反応速度が異なるため、MF6671、MF13415、5.33 AP、および NCTC 11168 株を選択しました。これらの株に対する繰り返し UV 曝露の影響を評価するには、2 回照射後の細菌の減少を調べました。 UV 治療を 1 回の治療による削減と比較しました (図 2 を参照)。 驚くべきことに、UV280 による 2 回目の処理の有効性は、MF6671 (1.81 ～ 0.78 Log CFU/mL) および MF13415 (1.43 ～ 0.78 Log CFU/mL) 株に 1 分間適用した場合、および MF13415 (1.43 ～ 0.78 Log CFU/mL) 株に 11 分間適用した場合に大幅に低下しました。 1.51 から 1.05 Log CFU/mL) (p < 0.05)。 さらに、5.33 AP では逆の効果が観察され、1 分間の曝露後は 0 から 0.49 Log CFU/mL に減少し、11 分間の曝露後は 1.23 ～ 2.35 Log CFU/mL に減少しました (p < 0.05)。 NCTC 11168 は、11 分間の曝露後に細菌減少が 0.39 Log CFU/mL から 1.05 Log CFU/mL に増加しました (p < 0.05)。 したがって、UV280で繰り返し処理すると、後者の株の感受性が大幅に増加しました。 さらに、UV280 で 11 分間処理すると、1 分間処理したものよりも 2 UV サイクル処理した C. ジェジュニ株の耐性が低下することが示されました (p < 0.05)。

280 nm で 1 分間および 11 分間、1 サイクルまたは 2 サイクルの UV にさらした場合に、選択した 4 つの C. ジェジュニ株で観察された細菌の減少 (Log CFU/mL)。 治療間の統計的差異は * で示されています (p < 0.05)。

WGS 分析は、UV 処理の前後で異なる不活化動態を示した C. ジェジュニ株のゲノムにおける潜在的な差異を調査するために実施されました。 9つのC.ジェジュニ株のパンゲノムを図3に示します。これらの株のコアゲノムでは、12,334個の遺伝子コールと1,356個の遺伝子クラスターが見つかりました。 さらに、全ゲノムは 2173 個の遺伝子クラスターと 15,414 個の遺伝子から構成されていました。 これらの株のパンゲノムは 2 つのクラスターを示し、そのうち MF6671、MF13415、5.33 AP、および C16 株は一緒にグループ化され、同様に NCTC 11168、A28f64、MF716、A21f105、および MF701989 株もグループ化されました。 分離された菌株の起源と供給源はクラスター化に影響を与えませんでした。

C. ジェジュニ株のパンゲノムのクラスターツリー解析、および UV 光にさらされていない 9 株に含まれる分離株の起源と供給源。

UV 処理した C. ジェジュニ株のゲノムにおける潜在的な変異を Snippy を使用して分析し、UV 処理したゲノムと未処理のゲノムを比較しました。 SNPとインデルに基づく変異のヒートマップを図4に示します。非コード配列（CDS）領域の変異、または仮説上のタンパク質に影響を与える変異は考慮されておらず、補足資料（補足表S.1）に記載されています。 一般に、280 nmのUV光に1分間または11分間曝露すると、NCTC 11168、3.55 APのゲノム、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするMF6671およびMF13415のapt遺伝子において、処理時間に関係なくUV誘導性の突然変異が発生しました。 さらに、SNP、欠失、挿入による変異も同様に観察されました。 変異した各遺伝子を KEGG 経路にマッピングして、細菌の機能と構造に対する UV 光の潜在的な影響を調査しました。 NCTC 11168 は、異なる UV 曝露時間に独立して曝露されたにもかかわらず、広範囲の代謝経路、構造、機能が UV 曝露によって影響を受け、同一の応答を示す最も多くの変異を有することが判明しました (図 4)。 waaA 遺伝子 (グリカン生合成および代謝) の SNP 変異は、11 分間処理した同じ株とは異なり、UV に 1 分間曝露した 5.33 AP 株で見つかりました。 さらに、5.33 AP を両方の曝露時間にさらした場合、翻訳、炭水化物、補因子、ビタミン代謝に関連する遺伝子の他の変異が検出されました。 UV曝露後、MF6671株とMF13415株では、ヌクレオチド代謝に関与するapt遺伝子に変異が生じた。 これら 2 つの株では、炭水化物とアミノ酸の代謝、鞭毛の集合、複製と修復に関連する遺伝子の他の変異が見つかりました。

選択した C. ジェジュニ株を 280 nm で 1 分間および 11 分間 UV にさらしたときの Snippy 所見のヒートマップが表示されます。変異の種類: 一塩基多型 (SNP)、挿入および欠失。 すべての変異遺伝子に含まれる KEGG 経路。

カンピロバクター バイオフィルムの増殖は、2 つの異なる温度 (37 °C と 4 °C) で好気条件と微好気条件の両方で、富栄養 (TSB) 培地と低栄養 (M9) 培地で評価され、結果は 24 時間のインキュベーション後に評価されました。 。 このプロトコルを、培養物を UV280 に 7 分間曝露して繰り返しました。 微好気条件下、37℃の栄養豊富な培地で増殖させた場合、各C.ジェジュニ分離株で最も強いバイオフィルム形成が観察されました。結果を表1にまとめます。9株のうち3株が強力なバイオフィルムを形成する能力を示しました。環境酸素濃度が存在しない低温では、利用可能な栄養素が低いため、ほとんどの分離株では弱いバイオフィルムの形成に寄与しました。 しかし、参照 C. ジェジュニ株 NCTC 11168 および分離株 C16、MF701989、MF13415、MF6671、5.33 AP、および a28f64 は、栄養制限 (M9) 培地の微好気条件下、37 °C である程度の中程度のバイオフィルム形成を示しました。 4℃の好気条件下では、富培地中では1つの分離株(a21f105)のみでより強力なバイオフィルム形成が観察されましたが、さらに2つの分離株(C16およびMF701989)では中程度のバイオフィルム形成が観察されました。 同じ条件下では、栄養豊富さが低いほとんどのカンピロバクター分離株で弱いバイオフィルムの形成が観察されました。

UV光で処理した分離株は、この研究で使用した各条件において、未処理の分離株と比較してバイオフィルム形成能力の低下を示しました。 豊富な栄養素 (TSB)、暖かい温度 (37 °C)、酸素の存在を伴う増殖条件により、UV280 処理細胞で最も強いバイオフィルム増殖が起こりました。ただし、バイオフィルム形成能力は、すべての株で未処理細胞ではまだ低かったですが、 a28f64 と MF6671 を分離します。 低い増殖温度と低い栄養豊富さ（M9培地）により、a21f105を除くすべての分離株でUV処理後のバイオフィルム形成が大幅に減少しました（p < 0.05）。 UV280 による処理により、調査した各分離株のすべての条件下でバイオフィルム形成が有意に減少しました (p < 0.05) (表 1)。

表 2 では、C16、5.33 AP、NCTC 11168 を除き、細胞懸濁液の UV 処理前に、9 株中 3 株がエタノール、家庭用漂白剤 (次亜塩素酸ナトリウム)、および家庭用表面洗浄剤溶液に対する感受性を示しました。これらの溶液の効果は、4 °C に曝露すると、大部分の C. jejuni 株で減少しました。 MF13415 株と NCTC 11168 株は 4 °C では細胞活性を示さなかったが、A21F105、C16、MF701989、MF716、および a28f64 を含む他の株は、推奨使用濃度であっても、研究した化合物に対してより高い回復力を示しました。 UV-LED 技術の適用により、9 株中 5 株でこれらの消毒剤の不活化効果が改善または維持されました。 それにも関わらず、42℃での分離株C16はUV処理後にエタノールに対する感受性の低下を示しましたが、界面活性剤ベースのクリーナーのみが42℃でUV処理したMF716に対して依然として効果を示しました。 同様に、EtOH および NaOCl ベースのクリーナーに対する耐性は、MF6671 の UV 処理セルでは高く、MF701989 では EtOH および表面クリーナーに対する耐性が高かった (表 2)。 特に EtOH に対する感受性の増加は、分離株 MF13415、NCTC 11168、特に 5.33 AP において UV 処理後にも見られ、試験された各クラスの抗菌薬に対してより感受性が高かった。 消毒剤を使用した場合、AP 5.33 の未処理の懸濁液がより大きな復元力を示したため、これは注目に値します。 UV 光への曝露と 4 °C でのインキュベーションにより、a21f105 のエタノールに対する感受性が増加し、MF701989 および 5.33 AP の NaOCl に対する感受性が増加しましたが、同時に、MF701989 は表面クリーナーに対する回復力の増加を示し、評価したすべての溶液に対する MF6676 の回復力が増加しました (表 2) ）。 興味深いことに、MF13415 および NCTC 11168 野生型は 4 °C では生存を示さなかったが、変異株はこの温度で生存できた。

液体、表面、食品中のカンピロバクター数を減らすための UV-LED 技術の応用は、他の研究で以前に調査されています 13、14、15。 しかし、著者らの知る限り、UV 処理後の細菌不活化動態の違いは、Haughton ら 14、Haughton et al.9、および現在の研究によってのみ評価されています。 以前の研究では、透明媒体中での 395 nm の紫外線に対するカンピロバクター分離株間の感受性の違いは、光強度減衰の要因ではなく、生物学的効果の結果であることが観察されました 14。 私たちの研究で UV-LED に対するカンピロバクターの感受性を評価し、菌株感受性を比較するには、透明な液体培地における UV-LED 技術の UV 光透過性と高い除染効果を低下させるために培地の吸光度を変更する必要がありました。 。 Haughton ら 14 と比較して、本研究で達成された細菌の減少は 6 log 低かった (図 1)。 これは、細菌細胞を保護し、細菌細胞の生存を促進する可能性がある培地中の UV 光の透過性が低下した結果である可能性があります 13。 Haughton et al.9 の研究では、MRD と UHT スキムミルクの混合物中の C. jejuni 懸濁液を 254 nm の UV ランプ装置で処理し、10 種類のカンピロバクター分離株すべてで最大 6 log CFU/mL の減少が観察されました。 、最も感受性の低い株では 3.5 log CFU/mL の減少が観察されました。 おそらく牛乳マトリックス中のより高い脂肪含量（2%）または UV 波長の違いのため、我々の研究では減少率は低かったものの（≤ 1.6 log CFU/mL）、調査後のすべての株で不活化の違いも観察されました。紫外線暴露。 9 つの C. jejuni 株のパンゲノム分析により、分離株の供給源と起源に関係なく 2 つのクラスターが得られました。 Thépault et al.16、Wilson et al.17、Méric et al.18 などの他の著者は、C. jejuni 分離株の起源と起源を相関させる目的で、そのパンゲノムを研究しました。 彼らは、遺伝子型の多様性が高いため、この作業は困難であると感じました。

観察された不活化反応速度の大きな変動に基づいて最も注目すべき菌株を選択し、280 nm で 2 サイクルの UV 光処理を行いました。 興味深いことに、280 nmのUV光による繰り返し処理は、UV単独処理と比較して、研究株におけるC.ジェジュニの減少に対して逆の効果をもたらした。 したがって、1 回の UV 処理後のより感受性の高い菌株は、2 回の UV サイクル後に耐性が増加し、その逆も同様です。 Álvarez-Molina ら 21 は、大腸菌、サルモネラ属菌の適応プロセスを調査しました。 とリステリア・モノサイトゲネスを10回のUVサイクル繰り返した後にUV光に照射し、その後細菌細胞がUV光に対してより回復力を持つことが観察されました。 これらの著者らは、この現象は細胞が致死未満のストレスにさらされたときの適応突然変異誘発の結果である可能性があると示唆しました19。 2 回の UV サイクル後の MF6671 および MF13415 についても同様の観察が行われましたが、NCTC 11168 および 5.33 AP 株で見られる UV 光に対する感受性の増加は前者とは対照的です。 単一の UV 処理を受けた場合、MF6671 および MF13415 が UV 光に対して最も感受性の高い株であり、5.33 AP および NCTC 11168 が最も回復力のある株であったことに注意することが重要です。 したがって、両方の効果の間に相関関係がある可能性があります。 しかし、現時点では科学文献から得られる情報が不十分であり、結論を導き出すことができません。 UV 処理した分離株のアライメントで検出された相違点は、細菌ゲノムに誘発されたミスセンス変異に起因する可能性があります。 これを検証するために、UV 処理した菌株と未処理の菌株のゲノムを比較する Snippy 解析を実施しました。 NCTC 11168 株と 3.55 AP 株は、2 回の UV サイクル後に感受性が高くなり、シグナル伝達と翻訳に関連する遺伝子に変異を示しました。 対照的に、遺伝子flipおよびfliR（鞭毛生合成タンパク質FliPおよびFliRをコードする）の変異は、2回のUVサイクル後のUV光に対する耐性がより高く、運動性と宿主の定着に関連している株で観察されました20。 これらの著者らは、これらの可逆的変異がカンピロバクター属のゲノム安定性（ゲノム堅牢性）を維持するための適応機構であることを示唆した。 UV20などのストレス要因に反応します。 fdtA 遺伝子（TDP-4-オキソ-6-デオキシ-アルファ-D-グルコース-3,4-オキソイソメラーゼをコードする）の変異も我々の研究で同定され、これは大腸菌の接着とコロニー形成に関連している21。 しかし、この遺伝子の機能はこれまで C. jejuni では記載されていませんでした。 さらに、この研究の最も感受性の低い株で見つかったpurF（アミドホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする）およびapt遺伝子の変異は、C.ジェジュニの遺伝的不均一性の促進に基づいて、生存確率を高めるためのC.ジェジュニの新規適応メカニズムと関連していることが証明されている。細菌集団22． 最後に、この研究で観察されたウラシル DNA グリコシラーゼをコードする ung 遺伝子の変異は、以前に他の研究でも検出されていました 23,24。 この遺伝子は、UV ストレスによって誘導される塩基除去修復 (BER) 経路の開始と関連しているが、Gaasbeek et al.24 および Dai et al.23 は、この遺伝子の変異は DNA 損傷や組換えの修復を促進しないと結論付けた。 C.ジェジュニで修理。 したがって、UVに対してより耐性のあるC.ジェジュニ株は、生存メカニズムに関連する突然変異を示しました。

この研究で行われたバイオフィルム形成解析では、研究したさまざまな条件（4 および 37 °C、好気性および微好気性、栄養豊富な培地および低栄養培地）で、未処理の C. ジェジュニ株でバイオフィルムの強度と存在/不在の変化が観察されました。 ）。 バイオフィルム形成における株の変動は、他の食中毒病原体でもすでに観察されています 25。 これらの著者らは、より現実的な条件下での細菌バイオフィルム形成を評価するにはさらなる研究が必要であると指摘しました25。 したがって、我々の研究は、涼しい、微好気性、または低栄養環境下であっても、バイオフィルム形成におけるC.ジェジュニの株の変動性を実証した。 一般に、紫外線は研究した株のほとんどでバイオフィルム生成を減少させ、追加のストレス（4℃および貧弱な栄養培地）の存在下ではより大きな減少が観察されました。 NCTC 11168 および 5.33 AP における前述の変異遺伝子の一部 (flhA、rcsC、mreB、および waaA) は、細胞の運動性、形態、およびペプチドグリカンの形成に関連しているため、バイオフィルムの形成に関連している可能性があります 26、27、28、29。 Luo et al.30 によると、UV 光技術は主に、既に形成されたバイオフィルム内に存在する微生物の不活化に関して評価されてきました。 それにもかかわらず、バイオフィルムの形成を防ぐための治療法として紫外線を調査した研究がいくつかあります30。 この点に関しては、大腸菌および緑膿菌の細胞によるバイオフィルム形成を防ぐための UV の使用を調査した研究が成功しました 31、32、33。 しかし、バイオフィルム形成プロセスに対する紫外線の破壊的な影響は長くは続かない可能性があります34。 本研究における細菌培養はわずか 24 時間培養されたため、この懸念を評価するにはさらなる調査が必要です。

EtOH および選択された表面クリーナーの抗菌活性は、細菌が低温にさらされると低下しました。 殺生剤のこの温度依存性の活性は、家庭用および工業用の表面洗浄剤の大部分について、数人の著者によって広範囲に実証されています 35。 私たちの研究と一致して、Bakht et al.36は、120の緑膿菌株において、EtOH 70%およびNaOCl 5%などの殺生物剤に対する抗菌剤感受性の変動を観察し、そのうち59株はEtOH 8.75%に対して耐性があり、33株はNaOCl 0.08に対して耐性を示した。 %。 本研究では、EtOH 70% および NaOCl 2% は 5.33 A.P. C. jejuni 株を 42 ℃ で不活化しませんでした。 同時に、C16 と NCTC 11168 は、同じ条件下で 2% 濃度の NaOCl に対して耐性がありました。 殺生剤に曝露する前に UV 光で処理すると、大部分の菌株で選択された殺生剤の抗菌効果が向上または維持されることが示されました。 EtOH または NaOCl と UV 光の組み合わせた阻害効果は、特に大腸菌、セレウス菌、クロノバクター サカザキ、ネズミチフス菌を含む他の病原性細菌に対して観察されています 37,38,39。 しかし、本研究での UV 処理後、4 つの C. jejuni 株は研究対象の殺生剤の少なくとも 1 つに対する耐性の増加を示しました。 UV曝露後のEtOHおよびNaOClベースの洗浄剤に対する耐性菌株として同定されたMF6671には、変異遺伝子aptおよびpurFが存在し、これらの細菌のストレス耐性が増加する可能性がある。 したがって、変異したプリン生合成遺伝子 (purF および apt) を持つ C. ジェジュニ細胞は、高浸透圧ストレスに対してより耐性がありました。 この現象は、UV 光の突然変異誘発性により発生する可能性のある交差防御メカニズムによって引き起こされる可能性があります 40。 Hartke ら 41 は、254 nm UV による前処理の Lactococcus lactis への影響を研究し、細菌培養物が 20% (v/v) エタノール、熱 (52 °C) および H2O2 (15 mM) に対する耐性を増加させることを発見しました。 これらの著者らは、UV ストレスと他のストレスの間に重複する調節経路が発生している可能性があると示唆しました 41。 私たちの知る限り、EtOH や NaOCl などの一般的な工業用および家庭用殺生物剤に対する UV 光の相互防御を発見した研究は不足しています。 今後の研究は、細菌ゲノムに対する紫外線の影響、誘発された突然変異、および交差防御との関連性をよりよく理解するために、この研究の結果とトランスクリプトーム解析の比較に焦点を当てる必要がある。

C. ジェジュニの合計 8 つの野外分離株と参照株 (NCTC 11168) を、アシュタウン (アイルランド、ダブリン) のティーガスク食品研究センターの微生物培養コレクションから入手しました。 拡張データセクションに示すように、菌株はさまざまな供給源（臨床および農場起源）から分離され、脱線維素化された馬の血液（Cruinn Diagnostics Limited、アイルランド、ダブリン）中で-80℃で保存されました。 分離株の調製は、Mueller Hinton 寒天プレート (Oxoid、Basingstoke、UK) 上の細菌ストックの蘇生と、その後の微好気性雰囲気下 42 °C で 48 時間のインキュベーションから構成されました。 コロニーを、カンピロバクター増殖サプリメント（Oxoid、英国ベイジングストーク）を補充した修飾木炭セフォペラゾンデオキシコール酸寒天（mCCDA、Oxoid、英国ベイジングストーク）上に画線培養した。 微好気的に42℃で48時間インキュベートした後、単離したコロニーを30 mLのミューラーヒントンブロス（MHB）（Oxoid、英国ベイジングストーク）に接種し、懸濁液を微好気条件下で42℃で48時間インキュベートしました。

細菌細胞懸濁液を４０００×ｇで１５分間遠心分離し、３０ｍＬの最大回収希釈剤（ＭＲＤ、Ｏｘｏｉｄ、英国ベイジングストーク）で２回洗浄した。 C. ジェジュニの最終濃度は、MRD (1:4、v:v) で希釈した超高処理 (UHT) ミルク (脂肪 2%) 20 mL で約 5 log CFU/mL に達しました。培地中の紫外線透過性と細胞の生存を促進します9。 細菌懸濁液 (20 mL) を、液の深さが約 6 mm、体積容量が 24 cm3 (高さ: 1.3 cm、直径: 5.8 cm) のペトリ皿に注ぎ、LED チャンバーの中心から 5 cm の距離に置きました。光源。 細菌懸濁液を、UV-LED デバイス (PearlLab Beam、Aquisense Technologies、ノースカロライナ州、米国) で 280 nm の波長で 1、3、5、7、9 および 11 分間処理しました。 UV-LED デバイスの詳細な説明が提供され、不活化効果が高い 280 nm の波長が選択されました 15,42。 未処理のサンプルは対照として機能しました。 UV280 線量は、測定された光のフルエンス率 (W/cm2) と治療時間 (分) を掛けて計算されました。 UV 光フルエンス率は、放射計 (Opticalmeter、モデル ILT2400、インターナショナル ライト テクノロジーズ、マサチューセッツ州、米国) を使用して測定し、0.041 W/cm2 であることが確認されました。 各治療時間の UV 光線量は拡張データ セクションに示されています。

UV処理直後に、各菌株のUV処理サンプルおよび対照サンプルの懸濁液中のC.ジェジュニレベルを測定した。 ＭＲＤ中で１０倍段階希釈を調製し、０．１ｍＬのアリコートをｍＣＣＤＡプレート上にプレーティングした。 微好気条件下、42℃で48時間インキュベートした後、細菌コロニーを数え、処理サンプルと対照サンプルの平均数を測定しました。 細菌の減少は、懸濁液１ｍＬ当たりのＬｏｇ ＣＦＵ単位で表した未処理サンプルから処理サンプルのＣ．ジェジュニ数を差し引くことによって計算した。

紫外線に対する感受性が異なるため、さらなる分析のために 4 つの C. ジェジュニ株 (MF6671、MF13415、NCTC 11168、および 5.33 AP) を選択しました。 菌株懸濁液を上記で詳述したように調製し、1 mLの懸濁液を9 mLのMRDに接種した。 これらの約 5 log CFU/mL の懸濁液を、試験したすべての菌株のカンピロバクター総数を 48 ～ 61% 減少させるために、ソースから 5 cm の距離で UV280 で 6 秒間処理しました (上記のように列挙)。 UV280処理後に生き残ったコロニーをMHB中で培養し、微好気的に42℃で48時間インキュベートした。 インキュベーション後、上で詳述したように、懸濁液をMRDミルクとUHTミルクの混合物に接種した。 この場合、不活化の動態が異なるため、牛乳と MRD 懸濁液を処理するために UV280 で 1 分間と 11 分間の曝露時間が選択されました。 未処理のサンプルを対照として使用しました。 4 つの C. ジェジュニ株の生存者の計数は、前述の手順ですべての処理サンプルと対照サンプルに対して実行されました。

MF6671、MF13415、NCTC 11168、および 5.33 AP 株の DNA 抽出は、メーカーの指示に従い、DNeasy® Blood & Tissue キット (Qiagen、マンチェスター、英国) を使用して、UV280 に 1 分間および 11 分間曝露した後、mCDDA 上で増殖したコロニーから実施しました。説明書。 抽出された DNA の純度は NanodropTM 1000 分光光度計 (ThermoFisher Scientific、英国イートン ソコン) を使用して評価し、DNA 濃度は Qubit 4.0 蛍光光度計 (Invitrogen、ThermoFisher Scientific、英国イートン ソコン) を使用して測定しました。 配列決定は、Teagasc Food Research Center Moorepark (アイルランド、フェルモイ) の配列決定センターで行われました。 DNA ライブラリーの調製は、Illumina DNA 調製キット (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を製造業者の指示に従って使用して実行しました。 続いて、NextSeq 2000 システム (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) と P2 試薬を使用して、2 × 150 bp によるシーケンスを実行しました。

試験した各菌株について生の配列が得られました。 UV280 で処理していない試験菌株の生配列は、Truccollo らによって行われた以前の研究から得られ 43、C. ジェジュニ NCTC 11168 の生配列は NCBI データベース (BioProject PRJNA8) から回収されました。 クリーニングは、アダプター、10% を超える未決定塩基を含むリード (N > 10%)、および Qscore が 5 以下 (Qscore ≤ 5) の低品質リードを取り外した後に、Trimmomatic (v0.3.8) を使用して実行される全身プロセスでした。総塩基の 50% が除去されました。 クリーニング後、FastQC (v0.11.8) と MultiQC (v1.9) プログラムを組み合わせて読み取りの品質を評価しました 44,45。 さらに進む前に、標準の Kraken 2 データベース 46 を介して Kraken 2 (v2.0.7 ベータ) を使用して株の特定を実行しました。 コンティグおよびスキャフォールドへのリードのアセンブリは、–careful オプションを指定した SPAdes (v3.13.0) を使用して実行されました。 足場の品質は、QUAST (v5.1.0) および MultiQC45、47、48 を通じて評価されました。 研究された C. ジェジュニ株のパンゲノムを視覚化するために、未処理株と処理株の組み立てられた scaffold.fasta ファイルで anvi'o (v7.1) ワークフローが使用されました (https://merenlab.org/2016/11) /08/pangenomics-v2/; 2022 年 11 月 23 日にアクセス)49。 前のファイルは、「anvi-gen-contigs-database」プログラムを通じて anvi'o contig データベースに変換されました。 このステップの後、オープン リーディング フレームを検出するために、足場内の遺伝子の同定が Prodigal で実行され、NCBI のオルソロガス グループ クラスター データベース (「anvi-run-ncbi-cogs」プログラム) を使用してそれらのアノテーションが 4 つの方向に実行されました。 anvi'o の HMM プロファイルは、隠れマルコフ モデル (「anvi-run-hmms」プログラム) によって提供されます。 パンゲノムを構築するために、アミノ酸配列の類似性が決定され、NCBI blastp を使用してすべてのゲノム内で比較されました。 0.552 の Minbit ヒューリスティックを使用してアミノ酸配列間の弱い一致を排除し、MCL アルゴリズム (「anvi-pan-genome」プログラム) 53 を使用してクラスターを特定しました。

Snippy (v4.3.6) を使用して、UV 処理株のゲノムを未処理株と比較しました。Snippy (v4.3.6) は、「バリアント コーリング」としても知られる、一塩基多型 (SNP) および小さな挿入および欠失 (インデル) に基づいて差異を確立します 54。

C. jejuni 分離株を、0.5% (v/v) の脱線維素化馬血液を含む Brain-Heart Infusion ブロス中で一晩増殖させました。 以前に評価された UV280 処理を使用して、これらの細菌懸濁液を 7 分間曝露しました。 続いて、これらの懸濁液をバイオフィルム形成アッセイに使用しました。 未処理のサンプルを対照として使用しました。 分離株をエッペンドルフチューブに等分し、13,000×gで5分間遠心分離した。 上清を除去し、ペレットを滅菌リンガー培地（Oxoid, Ltd.、英国ベイジングストーク）で洗浄した。 これを再度遠心分離し、上清を捨てた。 ペレットを Tryptic Soya ブロス (Oxoid, Ltd.、英国ベイジングストーク) および M9 培地 (MP Biomedicals Germany LLC.、ドイツ、エシュウェーゲ) に再懸濁し、滅菌 96 ウェル プレートに 200 μL ずつ加えました。 4 つの同一のプレートを準備し、それぞれを 4 つの条件の 1 つでインキュベートしました。環境酸素濃度下で 37 °C、微好気条件下で 37 °C、環境酸素濃度下で 4 °C、微好気条件下で 4 °C です。 24 時間後、培地を除去し、形成されたバイオフィルムをクリスタル バイオレット染色プロトコル 55 を使用して分析しました。 バイオフィルム形成の強さのパラメーターは論理テストに基づいていました: X > 1、"++++++"、X > 0.8、"++++"、X > 0.6、"+++"、X > 0.3、「++」、X > 0.1、「+」、H90 < 0.1、「－」、ここで X は 600 nm での光学密度 (OD) です。

カンピロバクター ジェジュニ分離株を、0.5% (v/v) の脱線維素化馬血液を含む Brain-Heart Infusion ブロス中で一晩増殖させました。 懸濁液を UV280 で 7 分間処理し、対照サンプルは処理しませんでした。 抗菌剤耐性の評価は、Balouiri et al.56 に従って実施されました。 簡単に説明すると、ミュラー・ヒントン培地中で一晩増殖させた細菌懸濁液をOD600 = 0.1に希釈し、続いてこの懸濁液1 mlを使用して45℃で融解したミュラー・ヒントン寒天培地に接種しました（ミュラー・ヒントン寒天培地中の5％脱繊維馬血液）。 設定したら、70% (v/v) エタノール (EtOH) (Sigma-Aldrich Ltd.、アイルランド、アークロー)、家庭用漂白剤 (< 5% 塩素系漂白剤など) を含む一般的な工業用消毒化合物の使用濃度を含む溶液を 10 μl ずつ採取します。薬剤、2% 次亜塩素酸ナトリウム）（Milton®、Proctor & Gamble、米国）、および家庭用表面洗浄剤（5-クロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オンおよび 2-メチル-2H-イソチアゾール-3-オン） ) (2Work Multi-Surface Cleaner、2Work Supplies、シェフィールド、英国) およびこれらの濃度の 50% を、産業または家庭環境での希釈事象を模倣する目的でプレートに添加しました。 好気性および微好気性条件下、42 °C で 48 時間増殖させた後、これらの抗菌化合物の存在下での細菌の増殖を評価しました 56。

UV 光処理は 2 回実施し、3 つの独立した実験を評価しました (N = 6)。 データの正規性はコルモゴロフ・スミルノフ検定を使用してテストされ、処理サンプルと対照サンプルの比較は、C. ジェジュニの各株について要因分散分析 (ANOVA) によって実行されました。 統計的差異は、α < 0.05 レベルで Tukey 事後検定を使用して取得されました。 GraphPad Prism プログラム (GraphPad Prism バージョン 8.4.2 Inc、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して統計分析を実行し、表示されたグラフを作成しました。 パンゲノムの視覚化は、anvi'o インタラクティブ インターフェイスとプログラム「anvi-display-pan」を使用して実行および編集されました。 断片的な発見は、R (v4.2.1; 2022-06-23) および RStudio (v2021.09.2) と pheatmap パッケージ (v1.0.12) を使用して視覚化されました。 パンゲノムとスニッピー フィギュアの品質は、Affinity Designer (v1.8.5.703、Serif) を使用して改善されました。

8 つの C. ジェジュニ分離株の生配列データは BioProject ID PRJNA688841 のデータセットから取得され、この研究からの UV 処理分離株の生データセットは BioProject ID PRJNA906059 で見つけることができます。

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この研究は、食品機関研究措置 (FIRM) プログラム [助成金番号: DAFM/17/F/275] の下で農水省 (DAFM) の支援を受けました。 アルトゥーロ・B・ソロは、ティーガスク・ウォルシュ奨学金プログラムによって支援されています。 著者らは、サンプルの配列を決定してくれたフィオナ・クリスピー博士とガストン・アレンデス博士に感謝したいと思います。

Teagasc Food Research Centre、アッシュタウン、D15 DY05、ダブリン、アイルランド

アルトゥーロ・B・ソロ、ダニエル・エクラス、デクラン・J・ボルトン、キャサリン・M・バージェス、ブリジェシュ・K・ティワリ

UCD 獣医学部、ユニバーシティ カレッジ ダブリン、ベルフィールド、D04 V1W8、アイルランド

アルトゥーロ・B・ソロ、ダニエル・エクラス、ポール・ホワイト

人間の感染症、食中毒病原体サービス、Sciensano、J. Wytsmanstraat 14、1050、ブリュッセル、ベルギー

Arturo B. Soro

UCD School of Agriculture and Food Science、University College Dublin、ベルフィールド、D04 V1W8、アイルランド

マシュー・マーミオン & アマリア GM スキャネル

UCD 食品安全センター、ユニバーシティ カレッジ ダブリン、ベルフィールド、D04 V1W8、アイルランド

マシュー・マーミオン & アマリア GM スキャネル

UCD Institute of Food and Health、University College Dublin、ベルフィールド、D04 V1W8、アイルランド

アマリア GM スカンネル

Teagasc Food Research Centre、アッシュタウン、ダブリン、D15 DY05、アイルランド

ブリジェシュ・K・ティワリ

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ABS は研究を概念化し、UV 光装置を使用した実験を実施し、実験作業の大部分を分析し、元の原稿と対応する改訂版を執筆および編集しました。 DE は原稿を修正および編集し、ABS と共同で WGS 分析およびバイオインフォマティクス分析を実行しました。MM はバイオフィルム形成および抗菌薬に対する感受性試験を含む実験を実施および分析し、原稿を修正および編集しました。 AS、PW、DJB、CMB、BKT が研究を監督し、原稿を編集および改訂しました。 BKTはプロジェクトの管理と資金調達を担当しました。

Brijesh K. Tiwari への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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ソロ、AB、エクラス、D.、マルミオン、M. 他。 UV 発光ダイオード (UV-LED) 技術に対するカンピロバクター ジェジュニ株の感受性の違いの調査。 Sci Rep 13、9459 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35315-0

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受信日: 2023 年 2 月 1 日

受理日: 2023 年 5 月 16 日

公開日: 2023 年 6 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35315-0

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